懸浮細胞的傳代

              懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中的懸浮，因此無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞的損傷也較小。懸浮培養(yǎng)時不進行生長培養(yǎng)基的更換；而是每2到3天加料一次，直到細胞匯合。可以直接在培養(yǎng)瓶中稀釋細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)擴增，或者也可以從培養(yǎng)瓶中取出一部分細胞，將余下的細胞稀釋到該細胞系適宜的接種密度。懸浮細胞的傳代后的延滯期一般比貼壁細胞要短。

懸浮細胞培養(yǎng)容器

              懸浮培養(yǎng)可采用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的無菌培養(yǎng)瓶（例如：不嗲折流板的搖瓶）進行；但是，專為懸浮細胞培養(yǎng)設(shè)計的轉(zhuǎn)瓶（攪拌瓶）具有出色的氣體交換功能，可進行較大規(guī)模的細胞培養(yǎng)。

             轉(zhuǎn)瓶有兩種基本設(shè)計；其培養(yǎng)基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌（即攪動）。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉(zhuǎn)瓶總培養(yǎng)體積不能超過轉(zhuǎn)瓶標示體積的一半，以便換氣充分（例如：500ml轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)液體不能超過250ml）。  

所需材料     

1. 裝有懸浮細胞的培養(yǎng)容器
2.  不帶折流板的搖瓶或者轉(zhuǎn)瓶
3. *生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃
4. 37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣
5. 磁力攪拌盤（如果使用轉(zhuǎn)瓶）、滾架（如果使用滾瓶）或者搖床（如果使用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿）
6. 用于活細胞和總細胞計數(shù)的試劑和設(shè)備（例如：countess™||自動細胞計數(shù)儀、臺盼藍染料或血球計數(shù)器。）

懸浮細胞傳代流程

             所有與細胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風櫥內(nèi)進行。傳代應(yīng)在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行。達到匯合狀態(tài)時，懸浮培養(yǎng)的細胞會聚集成團塊，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時培養(yǎng)基會變得渾濁。傳代前所建議的大細胞密度隨細胞系不同而有所差異。

            使用搖瓶進行細胞培養(yǎng)時

                                   以下實驗方案介紹了利用振蕩培養(yǎng)箱和搖瓶進行哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)時傳代的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書。

注：應(yīng)確保搖瓶中無折流板（即：位于培養(yǎng)瓶底部用于攪動的齒形板），因為折流板會破壞搖動節(jié)奏。

1. 當細胞適合傳代（即：處于對數(shù)生長期未達到匯合狀態(tài)）時，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶，使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細胞樣品。如果吸取樣品前細胞已經(jīng)沉淀，應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
2. 通過此樣品，采用countess™||自動細胞計數(shù)儀或者血球計數(shù)器、細胞計數(shù)儀按照臺盼藍拒染法測定總細胞數(shù)和活細胞百分比。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養(yǎng)基體積
4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時可將培養(yǎng)的細胞分到多個培養(yǎng)瓶中。
5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈，以便進行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養(yǎng)瓶放回振蕩培養(yǎng)箱。搖晃速度取決于具體的細胞系。

      注：為了盡量減少細胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積，每三周（或者必要時）應(yīng)將細胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀。

       使用轉(zhuǎn)瓶進行細胞培養(yǎng)時

 以下實驗方案介紹了利用轉(zhuǎn)瓶進行哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)時傳代的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書。

     請注意細胞對物理剪切作用很敏感。應(yīng)確保葉輪可自由轉(zhuǎn)動，不會觸碰到容器壁或底部。葉片頂部應(yīng)稍微高于培養(yǎng)基。以確保培養(yǎng)系統(tǒng)換氣充分。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動裝置，使葉片不會觸碰容器和底部。下表列出了不同尺寸轉(zhuǎn)瓶所需的小培養(yǎng)基體積。

我們建議開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時轉(zhuǎn)瓶容器不要超過500ml。建議從方法成熟、體積較小的轉(zhuǎn)瓶開始逐步擴大培養(yǎng)規(guī)模。

1. 當細胞適合傳代（即：處于對數(shù)生長期而未達到匯合狀態(tài)）時，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細胞樣品。如果吸取樣品前細胞已經(jīng)沉淀，應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
2. 通過此樣品，采用countess™||自動細胞計數(shù)儀或者血球計數(shù)器、細胞技術(shù)儀按照臺盼藍拒染法測定總細胞和活細胞百分比。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養(yǎng)基體積
4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時可將培養(yǎng)的細胞分到多個培養(yǎng)瓶中
5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈，以便進行充分的氣體交換，并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)速取決于所用細胞系和葉輪類型。應(yīng)確保轉(zhuǎn)速始終在推薦值范圍內(nèi)，以免剪切應(yīng)力導致細胞損傷。

注：為了盡量減少細胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積，每三周（或者必要時）應(yīng)將細胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀。

懸浮昆蟲細胞傳代的注意事項

                     雖然昆蟲細胞傳代的一般步驟與哺乳動物細胞相同，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同。為了獲得滿意結(jié)果，實驗中必須嚴格遵守所用昆蟲細胞系附帶的操作說明。

1. 進行細胞懸浮培養(yǎng)時無需更換培養(yǎng)基。定期傳代時需要吸出細胞懸液，然后加入適量培養(yǎng)基，將細胞稀釋到適當密度。添加新鮮培養(yǎng)基后可使細胞營養(yǎng)素達到*補充。
2. 培養(yǎng)昆蟲細胞時建議不要用二氧化碳交換。
3. 昆蟲細胞應(yīng)于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)?？蓪⒓毎旁诓僮髋_上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是，建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
4. 使用昆蟲細胞的培養(yǎng)基。
5. 使用表面活性劑降低剪切作用。進行昆蟲細胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時建議使用0.1％pluronic™。F-68pluronic™ F-68（BASF)是一種表面活性，可降低葉輪導致的細胞膜剪切作用 注：sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已經(jīng)含有表面活性劑。
6. 某些昆蟲細胞可能需要一定的過程來適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。更多信息，請參閱針對具體細胞的產(chǎn)品說明書或操作手冊。
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